ELISA實(shí)驗(yàn)中常見的組織樣本處理方法有哪些?

　　在ELISA實(shí)驗(yàn)中，組織樣本的處理方法直接影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。常見的處理方法包括以下幾種，具體選擇需根據(jù)目標(biāo)蛋白的性質(zhì)(如可溶性/膜蛋白)和實(shí)驗(yàn)需求(如總蛋白/特定組分分析)而定：

　　1. 組織勻漿法

　　適用：大多數(shù)可溶性蛋白(如細(xì)胞因子、酶、信號分子)。

　　步驟：

　　取材：新鮮或冷凍組織切成小塊，預(yù)冷PBS沖洗去血液。

　　勻漿：

　　機(jī)械勻漿：使用勻漿器(如Polytron)或研磨杵(冰浴操作)。

　　液氮研磨：對堅(jiān)硬組織(如骨骼、肌腱)更有效。

　　裂解緩沖液：

　　常用RIPA緩沖液(含蛋白酶/磷酸酶抑制劑)。

　　對脆弱蛋白可用溫和裂解液(如Tris-HCl + NP-40)。

　　離心：12,000×g, 4℃, 15-30分鐘，取上清(避免脂層和沉淀)。

　　注意：

　　保持低溫防止蛋白降解。

　　蛋白濃度需標(biāo)準(zhǔn)化(BCA/Bradford法)。

　　2. 分步離心法(亞細(xì)胞組分分離)

　　適用：研究特定細(xì)胞器(如線粒體、細(xì)胞核)中的蛋白。

　　步驟：

　　組織勻漿后，低速離心(500×g)去除細(xì)胞碎片。

　　逐步提高離心力(如10,000×g取線粒體，100,000×g取微粒體)。

　　各組分用裂解液溶解后檢測。

　　3. 酶消化法(適用于纖維組織)

　　適用：膠原豐富的組織(如皮膚、腫瘤)。

　　步驟：

　　用膠原酶、胰蛋白酶等消化(37℃, 30-60分鐘)。

　　終止消化后離心取上清。

　　4. 酸/有機(jī)溶劑提取法

　　適用：小分子肽(如神經(jīng)遞質(zhì))、某些磷酸化蛋白。

　　步驟：

　　用TCA或丙酮沉淀蛋白，再中和溶解。

　　5. 特殊處理(膜蛋白/難溶蛋白)

　　去垢劑處理：SDS、Triton X-100溶解膜蛋白。

　　超聲破碎：輔助裂解(冰浴間歇超聲，避免過熱)。

　　關(guān)鍵注意事項(xiàng)

　　抑制劑添加：蛋白酶/磷酸酶抑制劑必加(如PMSF、cocktail)。

　　標(biāo)準(zhǔn)化：

　　按組織重量(mg/mL)或總蛋白濃度(μg/μL)調(diào)整樣本量。

　　避免過度稀釋導(dǎo)致低信號。

　　預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：通過Western Blot或活性檢測確認(rèn)目標(biāo)蛋白未被降解。

　　示例流程(小鼠肝臟IL-6檢測)

　　取100 mg肝組織，液氮研磨成粉末。

　　加入1 mL RIPA裂解液(含抑制劑)，冰上勻漿。

　　4℃離心(12,000×g, 20分鐘)，取上清。

　　BCA法測蛋白濃度，用稀釋液調(diào)整至1 μg/μL。

　　按ELISA試劑盒要求加樣檢測。

　　根據(jù)目標(biāo)蛋白的定位和穩(wěn)定性，選擇合適方法可顯著提高檢測靈敏度!

　　注：以上資料僅供參考，不同品牌產(chǎn)品可能存在設(shè)計(jì)差異，操作前建議參考說明書‌。

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