Elisa試劑實(shí)驗(yàn)技能要點(diǎn)及常見問題解析

　　Elisa試劑實(shí)驗(yàn)技能要點(diǎn)及常見問題解析

　　ELISA實(shí)驗(yàn)核心技能要點(diǎn) 天正信達(dá)生物

　　一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

　　試劑與樣本處理‌

　　試劑平衡至室溫(20-25℃)30分鐘，避免冷凝水影響反應(yīng)‌

　　樣本分裝保存于-80℃，避免反復(fù)凍融，溶血/脂血樣本需離心處理‌

　　粉末標(biāo)準(zhǔn)品需渦旋溶解后靜置10-30分鐘，確保溶解‌

　　設(shè)備校準(zhǔn)‌

　　移液器定期校準(zhǔn)(尤其小體積加樣)，酶標(biāo)儀預(yù)熱10-15分鐘‌

　　恒溫箱溫度控制在37℃±0.5℃，避免邊緣效應(yīng)‌

　　二、關(guān)鍵操作步驟

　　加樣與孵育‌

　　加樣前混勻樣本，避免氣泡，槍頭貼壁加樣減少誤差‌

　　震蕩孵育(300 rpm)可提高反應(yīng)效率，37℃孵育時間需嚴(yán)格統(tǒng)一‌

　　洗滌與封閉‌

　　手工洗板時垂直拍板，避免交叉污染，扣干后立即加液‌

　　封閉液推薦5% BSA或脫脂牛奶，封閉時間≥30分鐘‌

　　顯色與終止‌

　　底物避光孵育(TMB顯色10-15分鐘)，終止液需及時添加‌

　　終止后30分鐘內(nèi)完成讀數(shù)，避免信號漂移‌

　　常見問題及解決方案

　　一、標(biāo)準(zhǔn)曲線異常

　　線性差(R²<0.99)‌：檢查標(biāo)準(zhǔn)品稀釋梯度，避免孔間污染‌

　　梯度不明顯‌：確認(rèn)酶標(biāo)儀波長校準(zhǔn)(450 nm/630 nm)‌

　　二、高背景信號

　　封閉不充分‌：延長封閉時間或更換封閉劑(如5% BSA)‌

　　洗滌不凈：增加洗滌次數(shù)(5次)，每次注滿洗滌液浸泡30秒‌

　　三、重復(fù)性差

　　加樣誤差‌：使用多通道移液器，同步操作復(fù)孔‌

　　孵育條件波動‌：恒溫箱加蓋，避免蒸發(fā)和溫度不均‌

　　四、靈敏度不足

　　顯色淡‌：延長底物孵育時間(預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化)‌

　　信號弱‌：檢查抗體效價，避免試劑過期或酶失活‌

　　數(shù)據(jù)判讀標(biāo)準(zhǔn)

　　OD值范圍‌

　　空白孔OD<0.2，標(biāo)準(zhǔn)品最高濃度孔OD>1.0‌

　　樣本OD值需落在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，超出需稀釋重測‌

　　質(zhì)控指標(biāo)‌

　　標(biāo)準(zhǔn)品CV%<8%，樣本CV%<20%‌

　　加標(biāo)回收率80-120%為合格‌

　　優(yōu)化建議

　　預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計‌：通過抗體滴定確定最佳工作濃度‌

　　環(huán)境控制‌：顯色過程嚴(yán)格避光，溫育過程減少開蓋‌

　　質(zhì)控對照‌：每板設(shè)置陰陽性對照，驗(yàn)證試劑活性

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