逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（包含基因組DNA清除劑） 天津天正信達(dá)供應(yīng)EzRed™ 核酸染料是一種超靈敏、極其穩(wěn)定且對環(huán)境安全的熒光核酸染料，可替代劇毒的溴化乙錠 (EB)，EzRed™ 核酸染料是一種的油性大分子，不能穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

     本產(chǎn)品是一種高效、穩(wěn)定、快速并可以去除基因組 DNA 污染的反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。試劑盒采用新一代反轉(zhuǎn)錄酶，大大提高了穩(wěn)定性和反轉(zhuǎn)錄效率。本試劑盒為一管式反轉(zhuǎn)錄預(yù)混液，5×RT Master Mix 中含有反轉(zhuǎn)錄鏈合所需的所有試劑（RTase、RNase Inhibitor、Random primers、Oligo dT Primer、dNTP Mixture、Buffer）。通常Real Time RT-PCR等實(shí)驗(yàn)需要先用 DNase I 消化去除RNA中殘留的基因組DNA(gDNA) ，但是傳統(tǒng)DNase I處理復(fù)雜并容易造成RNA的降解和損失。本試劑盒中使用了具有DNA分解活性的4×gDNA Removal 可2分鐘消除gDNA殘留，不需要DNase消化和后續(xù)繁瑣步驟。

適用范圍

鏈cDNA合成。可用于高拷貝、低拷貝基因的檢測。

產(chǎn)品組成

*5×RT Control Mix 和5×RT Master Mix 成分一致，只是不含RTase 反
轉(zhuǎn)錄酶，可以用于反轉(zhuǎn)錄的陰性對照。

運(yùn)輸和保存方法

－20℃ 保存，有效期 12 個月。

產(chǎn)品特點(diǎn)

1、新一代反轉(zhuǎn)錄酶大幅度提高了穩(wěn)定性和反轉(zhuǎn)錄效率。

2、采用gDNA Removal僅需2分鐘清除DNA殘留，不需要DNase 消化和后續(xù)繁瑣步驟。

3、全預(yù)混的反轉(zhuǎn)錄Mix，只需加入RNA和水，15分鐘簡單快速完成反轉(zhuǎn)錄。

4、同時(shí)2種Mix在-20℃不易凍結(jié)，減少了化凍和混勻時(shí)間，使用更簡單。

5、本產(chǎn)品針對qPCR進(jìn)行特別優(yōu)化oligo dT和N6隨機(jī)引物配比，使cDNA合成可從RNA轉(zhuǎn)錄本的各個區(qū)域起始并具有相同的反轉(zhuǎn)錄效率，保證了qPCR結(jié)果的真實(shí)性和可重復(fù)性。

操作步驟

(以20 μl反應(yīng)體系為例，也可以采用10μl反應(yīng)體系)

1、將模板RNA和5×RT Master Mix在冰上解凍；4×gDNA Removal 和RNase free H₂O 在室溫（15-25℃）解凍，解凍后迅速置于冰上。使用前將每種溶液輕彈或者輕微渦旋振蕩混勻，可簡短離心以收集殘留在管壁的液體到管底。

2、在RNAse free管里面加入以下成分：(建議使用PCR管冰上配制)

*Total RNA 建議不超過 2 μg，mRNA 不超過 200 ng (20μl 體系)

3、移液器輕輕吹打混勻，42℃孵育2分鐘（或者37℃孵育5分鐘）。控溫步驟均建議PCR儀器上進(jìn)行。

4、繼續(xù)直接在同一管加入如下成份：

5、移液器輕輕吹打混勻（總體積20 μl）

如使用mRNA模板是來源于真核細(xì)胞（如人、小鼠的組織細(xì)胞）含有Poly(A)尾結(jié)構(gòu)，42℃孵育15-20min。

如使用mRNA模板是來源于原核細(xì)胞（細(xì)菌）或者病毒等不含Poly(A)尾結(jié)構(gòu)，25℃孵育10 min，42℃孵育15-20min。

注意：如果模板具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)或高GC區(qū)域，可嘗試將反應(yīng)溫度提高至50℃，有助于提高產(chǎn)量。

6、85℃加熱 5 sec 失活RTase和gDNA Removal。

7、得到的cDNA產(chǎn)物可立即用于qPCR反應(yīng)，或在-20℃保存，并在半年內(nèi)使用；長期存放建議分裝后在-70℃保存。cDNA應(yīng)避免反復(fù)凍融。

RT-qPCR

     取適量反轉(zhuǎn)錄cDNA產(chǎn)物（一般不超過qPCR反應(yīng)體積的1/10）作為qPCR模板，按照廠家熒光定量PCR試劑說明書進(jìn)行下一步熒光定量PCR。 如果表達(dá)基因含量豐富，可以根據(jù)實(shí)際適當(dāng)稀釋cDNA模板使用。

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（包含基因組DNA清除劑）

注意事項(xiàng):

1、避免RNase污染。

2、為保證反轉(zhuǎn)錄成功建議使用高質(zhì)量的RNA樣品。

3、4×gDNA Removal 、5×RT Master Mix 非常粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸頭外導(dǎo)致?lián)p失，用前請點(diǎn)甩離心后使用，并且避免吸頭外壁沾附損失。4×gDNA Removal和5×RT Master Mix內(nèi)包含的酶均為過量，即使每次按照3.6 μl-3.8 μl使用，也不影響使用效果。

4、可以不經(jīng)過基因組去除步驟，直接用5 ×RT Master Mix 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，這樣所得到的結(jié)果會與使用RT Master Mix相當(dāng)。